Crema tópica antifúngica elaborada con el extracto hidroalcohólico de la especie endémica Piper ecuadorense Sodiro (matico)
Topical antifungal cream made with the hydroalcoholic extract from the endemic species Piper ecuadorense Sodiro (matico)
Santiago Ojeda-Riascos 1, Guisella Rivera 1, Leydy Nathaly Castillo1, Chabaco Armijos1, Jorge Ramírez1,*
1 Departamento de Química, Universidad Técnica Particular de Loja (UTPL), Calle M. Champagnat s/n, 1101608 Loja, Ecuador
* Correspondence: jyramirez@utpl.edu.ec
RESUMEN
El presente estudio describe el proceso de una adaptación tecnológica realizada a nivel de laboratorio para la preparación de una crema tópica con actividad antifúngica usando el extracto alcohólico (70%) de la especie endémica Piper ecuadorense Sodiro (matico). El comportamiento de las formulaciones semisólidas (crema) fueron evaluadas en función de las características organolépticas, fisicoquímicas y la actividad antifúngica in vitro de la crema a tres temperaturas de almacenamiento diferentes: (i) medio ambiente, (ii) 30 °C ±2 y (iii) 45 °C ±2, durante un tiempo aproximado de tres meses. Además de ello, otras características como el aspecto, textura, color, densidad, pH y extensibilidad fueron consideradas para determinar la formulación más estable. Referente a la dosificación del extracto etanólico para la inhibición del crecimiento fúngico, la crema elaborada usando 1% del extracto resultó ser la más efectiva al presentar una respuesta positiva frente a dos tipos de dermatofitos a los que fue expuesta, Trichophyton mentagrophytes ATCC® 28185 y Trichophyton rubrum ATCC® 28188, a una dosificación de 1000 µg/mL y durante un mes de evaluación. Dada la presencia de resultados antifúngicos promisorios, la fórmula desarrollada se encuentra en la posibilidad de ser empleada en estudios posteriores, con la finalidad de evaluar su eficiencia clínica en el tratamiento de infecciones tópicas de la piel.
Palabras clave: Crema tópica; extracto hidroalcohólico; Piper ecuadorense; actividad antifúngica.
ABSTRACT
The present study describes the process of a technological adaptation performed at the laboratory level to prepare a topic cream with antifungal activity using the alcoholic extract (70%) of the endemic Piper ecuadorense Sodiro (Matico) species. During processing, the behavior of semisolid formulations (creams) was evaluated in terms of organoleptic and physicochemical characteristics and in vitro antifungal activity of the cream at three different storage temperature conditions: (i) Environment, (ii) 30 °C ± 2, and (iii) 45 °C ± 2 for three months. Properties such as aspect, texture, density, pH, and extensibility were considered to determine each cream's stability. According to the dosage of the ethanolic extract to inhibit fungal growth, the cream made using 1% of the extract turned out to be the most effective formulation, so it gave a positive response against the two dermatophytes to which it was exposed, Trichophyton mentagrophytes ATCC® 28185 and Trichophyton rubrum ATCC® 28188 according to a dosage of 1000 µg/mL during one month of evaluation. Due to promising antifungal results, the developed formula could be used in further studies to evaluate its clinical efficiency in treating topical skin conditions.
Keywords: Topic cream; hydroalcoholic extract; Piper ecuadorense; antifungal activity.
INTRODUCCIÓN
El género Piper comprende cerca de 700 especies que están distribuidas en regiones tropicales y subtropicales del planeta, siendo América del Sur, América Central y el Sudeste Asiático las principales áreas donde se encuentran de manera abundante, de todas ellas, su gran mayoría tienen aplicación en medicina tradicional y como remedios antisépticos y anti-infecciosos 1. En Ecuador el género Piper cuenta con 157 especies nativas y 61 son endémicas, entre las cuales se incluye Piper ecuadorense 2.
En cuanto a su química, según estudios realizados por Roring & Von Poser, el género Piper agrupa siete metabolitos secundarios principales: amidas, lignanos y neolignanos, flavonoides, cavalactonas, alcaloides, ciclohexanos oxigenados, así como también aceites esenciales, entre otros 3.
En los últimos años, la investigación de los metabolitos secundarios del género Piper ha incrementado de forma significativa, dado que, fitoquímicamente, varias especies de Piper han demostrado una interesante actividad antifúngica, entre ellas: P. elongatum Vahl 4,5, P. fulvescens C.DC. 4,6, P. aduncum L. 4,7, P. crassinervium Kunth 4,8, P. lanceaefolium Kunth 4,9, P. angustifolium Lam.4, P. guineense Schumach y Tonn.4,10, P. tubercalatum Jacq., P. arboreum Aubl., P. hispidum Sw. 4 y P. coruscans Kunth 4,11.
Piper ecuadorense Sodiro, tradicionalmente conocida como matico de monte12, es un arbusto nativo de 2 metros de altura que crece de manera silvestre en las provincias de Carchi, Pichincha y Zamora Chinchipe entre los 0 y 2500 m s.n.m.13, por sus reconocidas propiedades terapéuticas P. ecuadorense es ampliamente utilizada en medicina tradicional en la provincia de Loja (sur de Ecuador), tanto por los pobladores de la provincia de Zamora Chinchipe que la emplean para lavar y cicatrizar heridas de la piel14. Así como en la comunidad indígena Saraguro perteneciente a la provincia de Loja, quienes utilizan las partes aérea de P. ecuadorense en mezcla con otras plantas para el tratamiento del "mal de aire"15, además de ser usada como cicatrizante, antiséptico de heridas y desinfectante16,12.
Debido a que los fármacos disponibles en la actualidad presentan una toxicidad importante y producen recurrencia o causan resistencia a cierto tipo de padecimiento, surge la necesidad de contar con nuevas sustancias naturales con propiedades antimicrobianas. Con estos antecedentes, el objetivo del presente estudio es la elaboración de un fitopreparado antifúngico semisólido para uso tópico, a partir del extracto fluido etanólico de la especie Piper ecuadorense Sodiro (matico de monte) y evaluar su actividad antifúngica para establecer su eficacia como tratamiento medicinal en contra de infecciones frecuentes en humanos causadas por diversos tipos de hongos. El extracto de P. ecuadorense es de alto interés para nuestro medio, dado que podría ser un sustituto con mayor eficacia en referencia a los agentes microbianos producidos por rutas sintéticas, pues en estudios preliminares de esta especie se ha aislado dos flavonoides conocidos como pinocembrim y pinostrombin17,18 los cuales han reportado una actividad antifúngica considerable de 62.5 µg/mL y 31.25 µg/mL frente a Trichophyton mentagrophytes y Trichophyton rubrum respectivamente18. Análogamente, se ha divulgado la composición química del aceite esencial de P. ecuadorense, en la que se evidencian como compuestos mayoritarios: biciclogermacreno ( ̴13%) y 3-tujopsanona ( ̴12%)19.
MATERIALES Y METODOS
Recolección y preparación del material vegetal
La especie P. ecuadorense, fue recolectada en la provincia de Zamora Chinchipe, Ecuador, latitud 4°4`0.7`` S, longitud 78°57.293` O. Posteriormente, las partes aéreas de la planta (ramas y hojas) fueron trasportadas en sacos de yute al laboratorio de tecnología Farmacéutica de la Universidad Técnica Particular de Loja (UTPL), donde se separaron y secaron a una temperatura de 37 °C por un periodo aproximado de 3 días, hasta logar un porcentaje de humedad promedio de entre 4 y 6%. De manera continua, la muestra fue triturada y tamizada hasta alcanzar una granulometría entre 250 y 600 µm20. La recolección del material vegetal se la realizó mediante el permiso del Ministerio del Ambiente de Ecuador (N°001- IC-FLO-DBAP-VS-DRLZCH-MA). La planta fue identificada por el Mgtr. José Miguel Andrade Morocho en el Departamento de Química de la UTPL y una muestra de vegetal fue depositada en el Herbario de la UTPL (HUTPL) con el código N.º (PPN-pi-007).
Métodos fisicoquímicos aplicados al análisis de drogas crudas
En la muestra vegetal en polvo se determinó el porcentaje de humedad, cenizas totales y cenizas solubles en agua, usando como referencia las técnicas sugeridas en el Manual de prácticas de farmacognosia y productos naturales21. De la misma manera, se determinò las cenizas insolubles en ácido clorhídrico, a partir del procedimiento indicado en Pharmacopeia National Formulary22.
Obtención del extracto fluido de Piper ecuadorense Sodiro
Con la finalidad de obtener el extracto de la especie P. ecuadorense, mediante el proceso de percolación con etanol al 70%, se maceró el material vegetal en la mezcla hidroalcohólica durante 48 horas, seguido de una rotaevaporaciòn a una temperatura de 35 °C, hasta alcanzar la eliminación de solvente y obtener un extracto con un mínimo contenido de humedad23.
Evaluación de la actividad antifúngica del extracto
Para determinar la actividad antifúngica de P. ecuadorense, se emplearon hongos esporulados (dermatofitos) Trichophyton mentagrophytes ATCC® 28185 y Trichophyton rubrum ATCC® 28188. El cultivo de hongos fue realizado sobre Caldo Sabouraud a 28 ºC durante un periodo de tiempo aproximado de 14-16 horas en agitación constante (120 rpm). Para los respectivos controles de los cultivos, se empleó DMSO (Dimetil sulfòxido) para el control negativo e Itraconazol 1 mg/mL para el control positivo.
Por otro lado, la determinación de la concentración mínima inhibitoria fue ejecutada en base al métdo Reference Method for Both Dilusion Antifungal Succeptibily Testin of Filamentous Fungi, M 38-A24. De esta manera, se partió de una solución de 20 mg/mL de extracto disuelto en DMSO y se realizaron soluciones dobles seriadas del extracto, ajustando los siguientes parámetros: concentración final del inóculo, 5 x 104 esporas/mL y concentración final de extracto de 1000 a 0.5 µg/mL. Como control positivo se empleó una solución de 1 mg/mL de Itraconazol. Se incubaron las placas a 28°C y se monitoreó el crecimiento de los hongos hasta las 96 horas de aplicación24,25.
Elaboración de la crema tópica
Se fabricó un lote de 1 kg del fitopreparado semi-sólido (crema). Los excipientes utilizados en la formulación fueron los siguientes: extracto fluido de Piper ecuadorense, alcohol cetílico, vaselina líquida, vaselina sólida, cetomacrogol, propilenglicol, metil parabeno, propil parabeno y agua purificada20; obteniéndose de esta forma una crema del tipo O/W (oleoso/acuoso)26. Con referencia al porcentaje de extracto empleado, se consideró la CMI (concentración mínima inhibitoria) presentada por el mismo, y basados en el procedimiento reportado en Sharapin (2000), en el apartado “Modelos de fichas de producción de fitofármacos semisólidos”20. La formulación del fitopreparado semi-sólido del tipo O/W de la especie P.ecuadorense, se describe en el tabla 1.
Tabla 1. Formulación de la crema antifúngica de P. ecuadorense.
Condiciones de almacenamiento de la crema
La crema fue envasada en tubos colapsibles de 10 g de capacidad27 y almacenada en las condiciones propuestas por el Instituto Nacional de Investigación en Salud Pública INSPI del Ecuador28.
Métodos de evaluación de la crema
Para la determinación de los parámetros fisicoquímicos de la crema de P. ecuadorense, tales como: densidad, pH y extensibilidad, se realizaron en referencia a las normas INEN 1595 1987-10, INEN 1596 1987-10 para pH y densidad respectivamente29,30. Para la determinación del índice de extensibilidad, se aplicó la metodología descrita en los estudios realizados por Pérez-Bueno et al.; Martínez Carmona & Tobón Zapata31,32.
Análisis microbiológico
Se determinò el límite de contaminantes microbiológicos presentes en la crema, al inicio y al final del estudio, en base a procedimientos reportados en Farmacopea Americana USP-NF 3233.
Características organolépticas
Como características organolépticas, se describieron cuatro parámetros: aspecto físico, coloración, textura y olor, diferenciados mediante la apreciación sensorial de los autores del presente estudio. Por otro lado, es importante mencionar la utilización de tablas colorimétricas para la apreciación del color de la crema de P. ecuadorense.
Actividad antifúngica de la crema
Para determinar la actividad antifúngica de la crema se utilizó placas TC24, partiendo de una concentración de 100 mg de crema en 1 mL de Agar Sabouraud y 1 mL de inóculo fúngico. Análogamente, se procedió con el mismo procedimiento para evaluar la actividad antifúngica del extracto, control negativo (DMSO) y control positivo (Itraconazol). Para la lectura de los resultados, estos fueron interpretados en base al crecimiento de hongo34.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Análisis fisicoquímico de material vegetal
Con respecto al análisis fisicoquímico del material vegetal de partida, la especie Piper ecuadorense, presenta un porcentaje de cenizas totales de 7.5% y cenizas insolubles en ácido clorhídrico del 1.5%. con un valor de 9.4% de humedad, según Cuellar & Miranda, 2014, estos valores se encuentran dentro del límite máximo permisible, el cual corresponde a un valor del 2% para cenizas insolubles en HCl y de 8-14% de humedad presente en material vegetal para extractos fluidos21.
Tabla 2. Análisis físico-químico del material vegetal seco.
Análisis organoléptico de la crema antifúngica
El preparado semi-sólido presenta un aspecto homogéneo, una textura cremosa y un color yellow-green group 145 D (característico del extracto), a diferencia de las cremas almacenas a temperatura ambiente y a 30 °C ± 2 que, al tercer mes, presentaron un ligero cambio de color a yellow-green group 150 D (tabla 3).
De la misma manera, referente al tercer parámetro en estudio, todas las muestras poseen consistencia espesa y cremosa, destacando que las almacenadas a 45 °C ± 2, una vez transcurrido el periodo de 3 meses, mostraron tendencia a la fluidez.
Tabla 3. Resultado de las pruebas organolépticas de la crema de P. ecuadorense.
Análisis fisicoquímico de la crema
En la tabla 4 se indican los resultados de los análisis fisicoquímicos de la crema a temperatura ambiente, 30 °C ± 2 y 45 °C ± 2, los mismos que fueron evaluados durante un periodo de 3 meses. Consecuentemente, se realizó un análisis estadístico utilizando el programa XLSTAT, obteniendo distintos resultados que mostraron lo siguiente: entre los factores pH y extensibilidad no existe una diferencia significativa, sin embargo, en cuanto a la densidad, existe una diferencia al comparar las condiciones de almacenamiento. Este hecho puede atribuirse a que el parámetro en estudio depende de la composición de la fase oleosa, la proporción de las fases y la concentración del emulsificante, que se encuentran fundamentadas en el grado de emulsificación. Por otro lado, se evidencia una relación directamente proporcional en referencia al comportamiento de la consistencia de la crema, es decir que, mientras más alta es la temperatura, la consistencia del producto pierde cierto nivel de viscosidad y presenta mayor fluidez, concluyendo que, la densidad también disminuye. Este fenómeno se ratifica mencionando que las cremas almacenadas a 45°C ± 2 no presentaron resistencia a la viscosidad a partir del 3 mes14.
Tabla 4. Resultado del análisis fisicoquímico de la crema de Piper ecuadorense.
Evaluación de la actividad antifúngica de la crema
Se comprobó que la crema (0.06%) sólo presentó actividad antifúngica frente a Trichophyton rubrum ATCC® 28188 hasta el primer mes de almacenamiento en todas las condiciones evaluadas. Es por ello que se procedió a realizar dos formulaciones adicionales en condiciones diferentes a las concentraciones del extracto, tabla 5, con el fin único de comprobar la actividad antifúngica del producto de P. ecuadorense. Para validar estas formulaciones se procedió en base a la misma metodología empleada para la evaluación de la crema al 0.06% durante 3 meses.
NA: no activo.
Tabla 5. Dosis del extracto (en la crema) para la inhibición del crecimiento fúngico.
La crema al 0.1% sólo presentó actividad frente a Trichophyton rubrum ATCC® 28188 a una dosis de 100 μg/mL, mientras que la crema al 1% es activa frente a los dos dermatofitos: Trichophyton mentagrophytes ATCC® 28185 y Trichophyton rubrum ATCC® 28188 a una dosis de 1000 μg/mL respectivamente, durante 1 mes. En comparación con un estudio realizado por Ramírez et al. (2013), se reporta la capacidad antidermatofita del extracto metanòlico de P. ecuadorense contra Trichophyton mentagrophytes y Trichophyton rubrum mostrando una concentración mínima inhibitoria (MIC) de 31.25 y 62.5 de µg/ mL, respectivamente18. De manera similar, Palacios et al. (2009), evaluó la actividad antifúngica de los extractos etanólicos crudos de las partes aéreas de Piper tuberculatum sobre Trichophyton rubrum, mismos que fueron altamente activos desde 0.5 a 1.5 mg/mL, inhibiendo el 100% del crecimiento del hongo35. Además, el extracto etanòlico de Piper betle mostró actividad antidermatofìtica sobre T. mentagrophytes con una CI50 entre 110,4―119,0 µg/mL (Trakranrungsie et al., 2008)36.
Los resultados de este estudio demuestran que la crema tópica formulada con extracto de Piper ecuadorense Sodiro presenta una notable actividad antifúngica in vitro frente a Trichophyton rubrum, Trichophyton mentagrophytes y Microsporum canis, tres de los principales hongos dermatofitos responsables de infecciones cutáneas en humanos. Concretamente, la crema al 1% demostró ser activa frente a T. mentagrophytes y T. rubrum a una dosis de 1000 μg/mL durante un mes. En cambio, la crema al 0.1% solo presentó actividad frente a T. rubrum a una dosis de 100 μg/mL.
Estos hallazgos son consistentes con investigaciones previas que han reportado la capacidad antidermatofítica del extracto de P. ecuadorense. Ramírez et al. (2013)18 observaron una concentración mínima inhibitoria (MIC) de 31.25 µg/mL para T. mentagrophytes y 62.5 µg/mL para T. rubrum utilizando un extracto metanólico de esta planta. Palacios et al. (2009) 35 también reportaron una alta actividad antifúngica de extractos etanólicos de Piper tuberculatum sobre T. rubrum a concentraciones de 0.5 a 1.5 mg/mL. Además, Trakranrungsie et al. (2008) 36 encontraron que el extracto etanólico de Piper betle inhibía el crecimiento de T. mentagrophytes con una CI50entre 110.4 y 119.0 µg/mL.
La actividad antifúngica observada podría atribuirse a la presencia de diversos compuestos bioactivos en el extracto de Piper ecuadorense. Tabanca et al. (2001) 38 atribuyen la capacidad antifúngica de varias especies aromáticas al biciclogermacreno, un compuesto mayoritario en la fracción volátil de P. ecuadorense. Ruiz-Vázquez et al. (2022)39 identificaron monoterpenos y sesquiterpenos en aceites esenciales de diferentes especies de Piper que inhibieron el crecimiento de hongos como Aspergillus niger, Botrytis cinerea y Alternaria alternata. Además, se ha reportado que el pinocembrin, un flavonoide aislado de P. ecuadorense, exhibe actividad antifúngica contra T. rubrum y T. mentagrophytes a una concentración de 125 µg/mL18,40.
Aunque el mecanismo de acción preciso de la crema antifúngica aún no se ha dilucidado, es posible que estos compuestos bioactivos actúen sinérgicamente para interferir con la síntesis de la pared celular de los hongos, alterar la permeabilidad de la membrana celular o inhibir enzimas esenciales para el crecimiento fúngico. Futuros estudios podrían enfocarse en determinar el mecanismo de acción específico de la crema y los compuestos responsables de la actividad antifúngica.
Es importante reconocer las limitaciones de este estudio, como el tamaño de la muestra, el tiempo de evaluación y las condiciones de almacenamiento. Además, se realizó in vitro, por lo que se necesitan estudios in vivo para confirmar la eficacia y seguridad de la crema en el tratamiento de infecciones cutáneas en humanos.
A pesar de estas limitaciones, los resultados obtenidos son prometedores y sugieren que la crema tópica con extracto de Piper ecuadorense podría ser una alternativa natural para el tratamiento de infecciones fúngicas de la piel. Futuros estudios clínicos podrían confirmar su eficacia en el tratamiento de diferentes micosis cutáneas.
CONCLUSIONES
Se determinó que el extracto hidroalcohólico de la especie P. ecuadorense presentó una marcada actividad antifúngica, por lo que se desarrolló una formulación farmacéutica semisólida con promisoria actividad antimicotica frente a Trichophyton rubrum y Trichophyton mentagrophytes. Consecuentemente, se desarrolló una crema tópica antifúngica, misma que fue sometida a tres condiciones de almacenamiento diferentes. Asimismo, los resultados obtenidos de los ensayos de estabilidad no presentaron cambios significativos en las características organolépticas, fisicoquímicas y microbiológicas, por lo que se concluye que la crema mantuvo su estabilidad durante el periodo de evaluación establecido de tres meses. Adicionalmente, se confirmó la actividad antifúngica de la crema hasta el primer mes que se evaluó la actividad, lo cual respalda el uso de esta planta en la medicina tradicional para tratar afecciones tópicas iniciadas por estos tipos de dermatófitos. En base a estos resultados, se valida la información de su uso tradicional como antifúngico en especial para tratar afecciones de la piel típico de la especie.
Material suplementario: No aplica.
Contribuciónes: "Conceptualización, S.O. and C.A.; metodología, G.R.; validación, S.O., J.R.; investigación, G.R.; recopilación de datos, L.N.C.; —preparación del manuscrito, C.A., J.R., G.R., L.N.C.; escritura—revisión y edición S.O., C.A. Todos los autores han leído y están de acuerdo con la publicación de la versión actual del manuscrito.
Fondos: No aplica.
Disponibilidad de datos: Todos los datos se encuentran contenidos en el artículo.
Agradecimientos: Al Departamento de Química de la Universidad Técnica Particular de Loja por el financiamiento de la investigación.
Conflictos de interés: Los autores declaran que no existen conflictos de interés.
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Received: May 19, 2024 / Accepted: September 30, 2024 / Published: December 15, 2024
Citation: Ojeda-Riascos S, Rivera G, Castillo L N , Chabaco Armijos J R. Crema tópica antifúngica elaborada con el extracto hidroalcohólico de la especie endémica Piper ecuadorense Sodiro (matico). Bionatura Journal 2024; 1 (4) 11. http://dx.doi.org/10.70099/BJ/2024.01.04.11
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