Bionatura journal

Entre los factores de riesgo de esta enfermedad, se pueden mencionar la exposición a radiación antes y después del nacimiento, mutaciones genéticas como el síndrome de Down, tratamientos con quimioterapia, infecciones virales como el virus linfotrópico humano de células T tipo 1 (HTLV1), el virus de Epstein-Barr (EBV), o tener un gemelo idéntico con LLA, entre otros ³. También este tipo de leucemia tiene su pico etario entre los 2 y 5 años ⁴, representando el cáncer más frecuente en pacientes pediátricos, siendo mucho menos común en adolescentes, adultos jóvenes y adultos mayores ⁵.

A nivel mundial los casos de LLA aumentaron de 49,1 mil en 1990 a 64,2 mil en el año 2017, mientras que la tasa de incidencia ajustada por edad disminuyó levemente. Es importante mencionar también que la mayor frecuencia de diagnóstico en niños y adultos jóvenes fue registrada en regiones en vías de desarrollo. Un ejemplo de ello es que >20% de los casos totales de LLA se han reportado en regiones de bajo índice sociodemográfico, mientras que en América Latina central representaron >30% ⁶.

En los últimos años la incidencia de la LLA de células B (LLA-B) ha aumentado a nivel global en comparación con el linaje de células T (LLA-T), especialmente en América Latina, debido a diversos factores como ambientes laborales que no cumplen con los estándares de control a exposiciones cancerígenas, la migración a lugares con peores condiciones ambientales, e incluso la exposición a nuevos agentes infecciosos ⁴.

En estos países las tasas de curación varían ligeramente, por ejemplo, en Chile y Argentina los porcentajes de supervivencia son de más del 70%, mientras que en México se estima que son de alrededor del 50% ⁷. En contraparte, las tasas de curación en países desarrollados superan el 90% en la mayoría de los casos infantiles y del 30 al 40% en el caso de pacientes adultos, esta significativa mejora se ha dado debido a los avances en el diagnóstico clínico y en la comprensión de la LLA ⁵.

Los métodos tradicionales de diagnóstico de la LLA han sido fundamentales tanto para la detección como para el tratamiento de la enfermedad. Desde un principio el diagnóstico de la LLA se iniciaba con el hemograma, donde se analizaban parámetros como la hemoglobina (Hb), hematocrito (Hct), recuento de glóbulos rojos (RBC), índices hematimétricos, contaje total de leucocitos (WBC) y plaquetas (PCT) ⁸, además de los análisis microscópicos que examinaban la morfología celular en busca de blastos y las tinciones citoquímicas, utilizadas principalmente para poder diferenciar la LLA de la leucemia mieloide aguda (LMA) ^5,9. No obstante, en la actualidad, estas características morfológicas rara vez son útiles para diferenciar los subtipos de la enfermedad, ya que, aunque puede detectar células leucémicas no proporcionan suficiente información para que los médicos confirmen el diagnóstico de esta enfermedad ^10,11.

Debido a estas limitaciones, se emplean otros métodos como la inmunofenotipificación a través de citometría de flujo o la inmunohistoquímica, cuyo objetivo es confirmar que las células leucémicas sean de origen linfoide ⁵. Asimismo, la necesidad de obtener una comprensión más amplia de la enfermedad ha impulsado el desarrollo y la aplicación de métodos enfocados en la genética, los cuales han permitido la identificación de nuevos subtipos moleculares de la LLA y el descubrimiento de nuevas alteraciones o mutaciones genéticas que predisponen al desarrollo de esta enfermedad ¹².

El presente artículo tiene como objetivo proporcionar una revisión exhaustiva de la evolución que han tenido las técnicas de diagnóstico de la LLA. A través de un análisis detallado de la literatura, se busca resaltar las limitaciones de las técnicas convencionales, como el hemograma y el análisis de frotis, así como el potencial de otras metodologías, incluyendo la citometría de flujo, la inmunohistoquímica y los nuevos enfoques basados en la genética. Este trabajo pretende no solo ofrecer una visión integral de la evolución del diagnóstico de la LLA, sino también subrayar la importancia de una detección temprana y precisa para mejorar los resultados clínicos en los pacientes.

En la gran mayoría de casos, el diagnóstico de la LLA gira en torno al hemograma completo (CBC, por sus siglas en inglés), debido a las situaciones clínicas que derivan a solicitar este análisis, además de los datos relevantes que se pueden obtener del mismo ¹³. De acuerdo con los parámetros analizados en el CBC la LLA cursa con anemia normocítica normocrómica; trombocitopenia, aunque uno de cada cinco niños no presenta esta alteración. En cuanto a los glóbulos blancos estos pueden encontrarse con niveles altos, bajos o normales, siendo así que, el 50% de los niños presentan contajes de menos de 11.000 leucocitos/μl en el hemograma inicial, el 20% tienen más de 100.000/μl y solo el 7% presenta contajes de 200.000 células/μl ^3,13. En cuanto a los adultos, los contajes de leucocitos rondan entre 30.000 a 100.000 células/μl ¹⁴.  En el frotis de sangre periférica el 90% de los pacientes suelen presentar células blásticas ¹⁵.

En el estudio de la MO es necesario demostrar la existencia de más del 25% de linfoblastos, además la médula tiene que presentar entre otras características, la hipercelularidad con una notable sustitución de los espacios adiposos y otros componentes medulares normales por células leucémicas, también se pueden observar algunos precursores mieloides y eritroides aparentemente normales y megacariocitos normales o ausentes⁹.

Por otra parte, el análisis de la morfología de las células sanguíneas permaneció como la principal herramienta empleada en el abordaje de la leucemia aguda para distinguir si esta era de origen linfoblástico o mieloblástico¹⁶. La clasificación más aceptada respecto a la morfología celular es la planteada por la asociación FAB (Franco-América-Británica), la cual analiza las características de las células luego de ser coloreadas por la tinción de Wright¹⁷o la tinción May-Grunwald-Giemsa¹⁵. Con estos parámetros la LLA es clasificada en 3 grupos: L1, L2 y L3, de acuerdo con el diámetro celular, la forma del núcleo, la cantidad y prominencia de los nucléolos, así como la proporción y aspecto del citoplasma⁹.

   

 

Utilizadas para poder diferenciar la LLA de la leucemia mieloide aguda (LMA), las principales reacciones que van a servir para realizar esta diferenciación son la mieloperoxidasa y el sudan negro¹⁸, ya que los linfoblastos son completamente negativos⁹. Los linfoblastos T muestran actividad paranuclear en la esterasa inespecífica cuando se realiza en un pH ácido, con más del 75% de actividad en la fosfatasa ácida. En la tinción de ácido periódico de Schiff (PAS), los linfoblastos generalmente presentan una coloración distintiva con gránulos gruesos o bloques masivos en forma de anillos concéntricos. Además, es más común encontrar una reacción PAS negativa en la LLA de linaje T que en la de linaje B⁹.  

   

 

Actualmente, de acuerdo con la Organización Mundial de la Salud (OMS) las leucemias agudas se clasifican a partir del linaje, ya sea mieloide o linfoide, lo cual se determina mediante la presencia de ciertos antígenos en las células malignas²⁰. La inmunofenotipificación representa uno de los métodos más importantes para clasificar correctamente a la LLA y para ello se utilizan dos técnicas diferentes: la inmunohistoquímica (IHQ) para el estudio de la biopsia de MO y la citometría de flujo (CF) en el análisis del aspirado medular²¹.

La IHQ detecta la interacción entre el antígeno y el anticuerpo mediante un cambio colorimétrico, que puede observarse a través de un microscopio óptico o bien con marcadores de fluorescencia utilizando un microscopio con este mismo enfoque. Esta técnica se utiliza en secciones de tejidos fijados con formaldehído e incrustados en parafina, y habitualmente se emplea un único anticuerpo por sección^15,22. En un principio, se vio limitada por el uso de anticuerpos de baja afinidad o interpretaciones erróneas, sin embargo, actualmente y con los avances tecnológicos realizados, la IHQ es mucho más útil en el análisis de células que son demasiado frágiles como para soportar el procesamiento de la muestra usando la CF. Entre estos avances se destacan la recuperación de antígenos, implementación de equipos automatizados de tinción y la producción comercial de anticuerpos²⁰. Basándose en estos puntos, la IHQ se ha convertido en una técnica mucho más accesible y que proporciona resultados mucho más rápidos manteniendo e incluso mejorando la precisión de estos.

El primer paso en este proceso es la recuperación del antígeno, lo que implica un pretratamiento del tejido para recuperar los antígenos ocultos por el proceso de fijación y así facilitar su acceso para la unión con los anticuerpos. Posteriormente, se añade el anticuerpo primario que se va a unir al antígeno de interés, se lava el exceso de anticuerpos no unidos y se aplica el antígeno secundario conjugado con enzimas (como la peroxidasa de rábano picante) o con marcadores fluorescentes. En el caso de que se trate con una enzima es necesario añadir un cromógeno (por ejemplo, NovaRED) para visualizar el cambio de color en un microscopio óptico. Finalmente, se realiza una contratinción con hematoxilina seguido de un proceso de deshidratación, aclarado y montaje para el análisis de la muestra, ya sea en un microscopio óptico o de fluorescencia²².

   

   

De acuerdo con los estudios realizados por Rani et al ²³, y Kasonkanji et al ²⁴, acerca de la clasificación de leucemias agudas utilizando esta técnica se hace uso de un panel de marcadores de incluye CD34, MPO, CD117, CD3, CD20, PAX5, TdT y CD10. Para diferenciar entre LLA y LMA se usaron MPO y CD117. En cuanto a la distinción en la línea linfoide, la LLA-B fue positiva para CD34, CD20, PAX5, CD10, mientras que la LLA – T mostró positividad para CD34, CD3 y TdT. También se menciona que otros antígenos de células T como CD2, CD5 y CD7 no son específicos de este linaje y pueden manifestarse de forma anormal en la LMA.

Esta técnica representa una tecnología potente capaz de procesar decenas de miles de partículas por segundo y de identificar subpoblaciones mediante herramientas de análisis multiparamétrico²⁵. Para realizar esta técnica las células o partículas que se van a analizar deben encontrarse suspendidas en un fluido como la solución salina tamponada con fosfato (PBS). Esta suspensión requiere someter a la muestra, que en este caso es un aspirado de MO o sangre periférica (únicamente en caso de que la MO sea de mala calidad o se observe una blastosis periférica masiva), a un proceso de lisis – tinción – fijación y lavado. Las células van a ser teñidas con un panel de anticuerpos conjugados a fluorocromos como isotiocianato de fluoresceína (FITC), ficoeritrina (PE), aloficocianina (APC), proteína peridinina clorofila cianina 5.5 (PerCP Cy5.5), APC H7 y PE Cyanin 7 (PE Cy 7)^26–28.

Al pasar por el citómetro de flujo, las células se disparan a través de los rayos láser a altas velocidades y es en esta intersección en donde la óptica de recolección de luz capta la fluorescencia y la dispersión de luz de cada célula^25,26. El uso de uno o varios láseres, al incidir sobre las células, permite medir sus características por la dispersión frontal, lo que refleja el tamaño y por la dispersión lateral la complejidad interna o granularidad de cada célula. Además, al incidir el láser sobre las moléculas de fluorescencia estas se excitan y envían una señal^15,25.

Es así como mediante estas técnicas se pueden detectar los antígenos presentes en la superficie de las células blásticas de cada estirpe (T o B). Además, también se identifican a los subtipos que van a corresponder con los diferentes estadios de diferenciación de los linfocitos normales¹⁵.

 

También cabe recalcar que enfrenta desafíos, como el bajo volumen y la baja viabilidad celular, resultados engañosos debido al cambio fenotípico, así como el manejo de grandes cantidades de datos, además de que se considera que su sensibilidad es subóptima ^21,29. Es por ello por lo que se busca implementar el uso del flujo de próxima generación, que ofrece mejorar la interoperabilidad y sensibilidad²⁹.

En casos de fibrosis en la MO, la cantidad de células obtenidas para CF disminuye considerablemente, lo que a veces impide su uso para el diagnóstico, convirtiendo al estudio de la biopsia de MO mediante IHQ en la herramienta diagnóstica alternativa²¹.

La LLA se describe como una enfermedad de origen genético, debido a que en la gran mayoría de casos se encuentran alteraciones genéticas adquiridas (mutaciones somáticas), las cuales favorecen el incremento del proceso proliferativo, la supervivencia prolongada y/o la diferenciación incorrecta de las células progenitoras linfoides. Es por ello por lo que tanto los hallazgos citogenéticos como los genéticos moleculares representan factores pronósticos importantes al momento del diagnóstico de la LLA, ya sea en niños o adultos³⁰.

Dentro de la citogenética se pueden mencionar principalmente al análisis convencional o estándar y la hibridación in situ por fluorescencia (FISH, por sus siglas en inglés).

·         Análisis citogenético estándar.

En esta técnica se pueden detectar microscópicamente las anomalías en los cromosomas, sin importar si son anormalidades en el número de cromosomas o en su estructura³¹. Para ello es necesario obtener células en metafase, en donde las cromátidas se encuentran condensadas y la morfología de los cromosomas está bien definida³². Las muestras se someten a cultivos in vivo no estimulados en un período corto (24 a 48 horas), y posterior a este tiempo se detiene la división celular al exponer el cultivo a diversas sustancias (colamida principalmente). Estas muestras se van a teñir usando técnicas de banda (generalmente bandas G) y se analizan en el microscopio. Para poder confirmar que un caso es citogenéticamente normal es necesario analizar por lo menos 20 cariotipos de una muestra de MO y en caso de encontrar aberraciones cromosómicas, estas se consideran relevantes cuando son clonales. Esto significa que deben encontrarse en al menos dos células en metafase si se trata de una aberración estructural idéntica o de una ganancia de un cromosoma intacto (trisomía), en el caso de un cromosoma que falta (monosomía), deben estar presentes en al menos tres células^30,31.

Mediante esta técnica se pueden detectar aneuploidías (hiper o hipodiploidías) y otros reordenamientos cromosómicos comunes. Sin embargo, el cariotipo convencional no suele ser lo suficientemente sensible en la detección de reordenamientos que son crípticos, es decir, que son muy pequeños y más complejos¹⁰. Además, la precisión del análisis de cariotipos depende de la obtención de metafases de alta calidad provenientes de células neoplásicas. Sin embargo, en casos donde los blastos tienen un bajo potencial de proliferación o en situaciones de alta hiperdiploidía, es posible que no se generen metafases analizables, lo que podría llevar a una interpretación errónea de los resultados³².

En la LLA-B, se encuentran varias alteraciones como diferentes tipo de ploidía: hiperdiploidía (> 50 cromosomas), hipodiploidía (entre 24 y 31 cromosomas denominado casi hiploide o entre 32 y 39 cromosomas denominado bajo haploide) y traslocaciones como t(9;22), KMT2A -r, t(5;14); t(1;19) . Mientras que, en la LLA-T, aún no se ha establecido una clasificación exacta acerca de las alteraciones detectadas mediante el cariotipo convencional, lo cual puede deberse a que la cantidad de casos citogenéticamente normales es mayor que en la LLA-B^30,33.

Aproximadamente un tercio de los pacientes con LLA-T presenta una translocación que involucra alguno de los genes del receptor de células T (TCR), con puntos de ruptura en 14q11 (TCRA/TCRD) o 7q34 (TCRB). La translocación más frecuente en adultos es t(10;14)(q24;q11.2), la cual provoca la sobreexpresión del gen TLX1 (HOX11) y está vinculada a un pronóstico favorable. En niños, alrededor del 3 y el 6% de los casos presentan una translocación t(1;14)(p32;q11.2), que coloca al gen TCRD junto al gen TAL1, lo que provoca la sobreexpresión de este último. Además, esta sobreexpresión puede ocurrir debido a una deleción críptica en el cromosoma 1, lo que provoca una fusión entre los genes TAL1 y STIL. Esta fusión específica, TAL1-STIL, se observa en un 16–26% de los casos, convirtiendo a las alteraciones relacionadas con TAL1 (tanto la translocación como la fusión) en las anomalías genéticas más comunes en este tipo de leucemia infantil³⁰.

Si bien el cariotipo convencional ofrece una perspectiva amplia y completa de las aberraciones cromosómicas presenta ciertas limitaciones como el realizar un cultivo celular que demanda mucho tiempo y que tiene probabilidades de fracaso, una interpretación que depende de la experiencia del analista y una resolución máxima de entre 5 a 7 megabases (Mbp)³⁴.

·         FISH

El principio en el cual se basa esta técnica es la hibridación de sondas de ADN de cadena simple marcadas con fluoróforos a sus secuencias genómicas complementarias³². El procedimiento se puede iniciar con las células preparadas en la técnica del cariotipo convencional, depositando las mismas en un portaobjetos e incubando durante 2 minutos a 45°C en una placa caliente, para luego empapar el portaobjetos en citrato salino de sodio (SSC) por 5 minutos. Posteriormente, se somete a un proceso de deshidratación con diferentes grados de alcohol (70%, 85% y 100%) y se procede a agregar la sonda, se coloca un cubreobjetos y la muestra se somete a una desnaturalización seguido de una hibridación durante toda la noche. Al día siguiente se realiza otra hibridación con SSC y finalmente los portaobjetos se tiñen con los fluorocromos que pueden ser 4,6-diamino-2-fenilindol (DAPI), isotiocianato de fluoresceína (FITC), cloruro de ácido sulforodamina 101, entre otras. Las señales de fluorescencia se van a detectar utilizando un microscopio específico para este fin^35,36. Cabe destacar que las sondas que se utilizan son fragmentos de ADNc o ADN genómico que son complementarias a secuencias específicas en el genoma humano³⁰.

La ventaja de la FISH es que no requiere de células vivas, ya que se pueden analizar células tanto en metafase como en interfase, a diferencia del cariotipo convencional que ocupa exclusivamente células en metafase, además permite analizar con mayor rapidez un gran número de células e identificar cambios estructurales que son más sutiles para la resolución de la citogenética convencional³⁷. Sin embargo, no puede identificar pequeñas deleciones y mutaciones³⁸.

Actualmente, esta técnica es usada en la detección de translocaciones, inversiones, inserciones, microdeleciones y en la identificación de cromosomas llamados marcadores o de referencia, además también es útil en la delimitación de los puntos de ruptura a nivel cromosómico³⁹.

Se utilizan varios tipos de sondas que cumplen con una función en específico de acuerdo con lo que se intenta encontrar o detectar. Entre estas se encuentran las sondas centroméricas, sondas de pintado cromosómico y las sondas de secuencia única o locus específico. Mediante esta última sonda se puede detectar al cromosoma Filadelfia en la LLA, que se forma debido a la traslocación t(9;22), presente en el 5% de los casos y que representa un mal pronóstico³⁷. También se ha logrado detectar el gen de fusión ETV6/RUNX1, identificar patrones de hibridación atípicos y la amplificación intracromosómica del 21 (iAMP21)³⁹.  

De acuerdo con la clasificación actualizada por la OMS en el 2016, de todas las anomalías genéticas recurrentes que se presentan en la LLA, las traslocaciones suelen ser las más frecuentes. Estas al ser analizadas desde una perspectiva molecular son las causantes de la formación de genes de fusión, creados a partir del intercambio de material entre cromosomas y que se puede detectar en el ácido ribonucleico (ARN) mediante la reacción en cadena de la polimerasa con retrotranscripción (RT-PCR)⁴⁰.

-          RT-PCR

Se describe como una variante de la PCR convencional y consta de 2 procesos⁴¹. El primero de ellos inicia con la trasncripción inversa, en donde se va a tomar un fragmento de ARN para convertirlo en ADN complementario (ADNc) por acción de la trasncriptasa inversa. El ADNc obtenido va a servir como molde para realizar la PCR convencional, que inicia con la desnaturalización del ADN para separar las cadenas dobles, después se añaden los cebadores o primers para su unión con las cadenas simples de ADN que, cabe destacar, van a ser diseñadas exclusivamente para las necesidades de cada estudio realizado. Por último, la elongación o extensión que es catalizada por la ADN polimerasa, resultando en la duplicación del material genético^14,41,42.

   

Presenta una alta sensibilidad (0,01% a 0,001%), superior a otras técnicas como la CF, que le permite detectar una célula maligna entre 10 000 a 100 000 células normales¹⁴. Utilizando cebadores dirigidos hacia distintos genes de fusión se han logrado detectar varios reordenamientos importantes como BCR::ABL1, TCF3::PBX1 , ETV6::RUNX1 y UBTF::ATXN7L3. Además, se considera que la implementación de esta metodología es especialmente útil para la detección de reordenamientos crípticos y comprobación de la expresión y estructura de nuevos genes de fusión identificados por otras metodologías como FISH. Sin embargo, su uso se limitado por la gran heterogeneidad molecular que generan las fusiones génicas, tal es el caso del subtipo BCR::ABL1-like, en el que están involucradas varias quinasas ¹⁰.

Se considera que, aún en la actualidad al momento de realizar el análisis genómico de la LLA se utilizan técnicas de bajo rendimiento como la FISH, debido a que el número de alteraciones que detecta es muy limitado, es por ello por lo que se espera modernizar las técnicas diagnósticas con la introducción de otras tecnologías como la secuenciación de nueva generación (NGS, por sus siglas en inglés)⁴³. También se puede utilizar para monitorear la EMR, consiguiendo mejores resultados al alcanzar una sensibilidad de hasta 1x10^-6, de acuerdo con el estudio realizado por Short et al ⁴⁴, del total de pacientes que tuvieron resultados negativos para EMR mediante CF, el 46% resultó positivo al realizar el estudio utilizando NGS. Se demostró de esta manera que, esta técnica puede detectar incluso aquellos casos en los que las células leucémicas son casi imperceptibles para otras técnicas que se usan comúnmente en el diagnóstico convencional de la LLA.

La NGS es una técnica avanzada que permite identificar de manera eficiente y rápida cambios moleculares en las células tumorales. Tradicionalmente estos cambios genéticos se detectaban mediante citogenética convencional, FISH o PCR, sin embargo, al buscar mejorar la relación coste-eficiencia se implementó esta nueva técnica capaz de detectar múltiples aberraciones genéticas a la vez⁴⁵. De acuerdo con la complejidad que represente el análisis requerido y la información que se quiera obtener se pueden realizar distintos tipos de secuenciación, entre las que se incluye a la secuenciación del genoma completo (WGS), secuenciación del transcriptoma (RNA-seq) y secuenciación del exoma completo (WES)⁴³. Cabe señalar que todas estas técnicas no forman parte del estudio estándar para el diagnóstico de la LLA, sin embargo, se llevan a cabo en los laboratorios de investigación para lograr establecer una clasificación mejor definida de esta enfermedad²⁹.

En un principio esta técnica se veía limitada tanto por su precio como por la complejidad de su uso. A partir de 2001, cuando se estaban realizando los primeros experimentos el costo se ha reducido drásticamente de 100 millones de dólares a 1000 dólares, aunque este precio aún es considerablemente alto se espera que siga bajando en los próximos años. Asimismo, las herramientas bioinformáticas empleadas para analizar la gran cantidad de datos obtenidos a partir de la secuenciación han sido mejoradas mediante el perfeccionamiento de nuevos algoritmos y canales⁴³.

Esta técnica se divide en 4 procesos esenciales: preparación de la muestra, preparación de la biblioteca, generación de grupos y secuenciación^46,47. El ADN de alto peso molecular se aísla a partir de sangre completa (EDTA o citrato), tejidos extirpados quirúrgicamente o biopsias, para luego ser fragmentado y generar la biblioteca. Aquí también se agregan los adaptadores y el ADN enlazador. Posteriormente, las bibliotecas se cargan en una celda de flujo y se sitúan en un secuenciador en donde los fragmentos de ADN van a amplificarse mediante una polimerasa. Con un detector láser de fluorescencia se detecta la señal producida y los datos finalmente se transfieren a una computadora de alto rendimiento para ser analizados y comparados con el genoma de referencia humano^43,46. Por lo cual, esta técnica es especialmente valiosa para estudiar o detectar variaciones estructurales⁴³.

Considerada útil para estudiar mutaciones puntuales, especialmente en subclones leucémicos durante la recaída. Esta técnica comparte un flujo de trabajo bastante similar a WGS, con la excepción de que, a diferencia de dicha técnica, esta va a centrarse únicamente en las regiones codificantes, es decir, los exomas. Cabe mencionar que se van a ocupar bases de datos como la del Consorcio de Agregación de Exomas para obtener más información del efecto biológico de las alteraciones identificadas⁴³.

Se emplea para analizar la expresión de ARNm o ARN no codificante, y puede identificar tanto mutaciones en la secuencia como genes de fusión, los cuales también pueden ser detectados por el WGS⁴³. Este análisis consta de 3 pasos fundamentales: alineamiento, cuantificación y análisis diferencial^48,49. El proceso de preparación de una biblioteca de RNA-seq comienza con la obtención y aislamiento del ARN de una muestra biológica, que puede provenir de una línea celular o de un tejido previamente congelado. Posteriormente, el ARN es transformado en ADNc mediante una transcripción inversa, el ADN obtenido va a ser fragmentado en secuencias cortas. La biblioteca creada a partir de este proceso se convierte en la entrada a una plataforma de secuenciación que va a generar las lecturas correspondientes al comparar o alinear estas con otra secuencia de referencia⁵⁰.

 

 

Se recalca ampliamente que las tasas de curación y supervivencia de la LLA rondan el 90%, sin embargo, estos datos pertenecen únicamente a los países de altos ingresos. Esto se debe a que las técnicas más avanzadas ya han sido implementadas en dichos lugares⁵². En contraste, tanto en América Latina como en otros países de ingresos medios bajos, los resultados están significativamente por debajo de los estándares internacionales establecidos, tanto en pacientes pediátricos como adultos. Además, la disponibilidad de las pruebas basadas en la citogenética o biología molecular varía ampliamente y depende en gran medida del ámbito económico.

Actualmente, la medición de la EMR es considerado como el factor pronóstico independiente más importante, ya que, facilita la adaptación de la intensidad de la quimioterapia y el ajuste de las estrategias de consolidación⁷. Los ensayos preferidos para realizar estos análisis son la PCR y la CF, está última siendo la menos accesible y asequible, debido a que la distribución de laboratorios que realicen técnicas genéticas y citogenéticas se concentra por lo general en áreas urbanas principales, lo que provoca una alta demanda que colapsa los sistemas de salud en Latinoamérica. Lo cual subraya la necesidad de mejoras en la gestión gubernamental que permita el acceso a estas herramientas.

La implementación de técnicas más avanzadas es de suma importancia debido a que mediante la detección de anomalías genéticas específicas que son recurrentes y la medición de la EMR al finalizar la terapia de inducción es posible establecer una clasificación de riesgo (bajo, estándar, alto o muy alto). Esta combinación ha dado grandes resultados en cuanto a la mejora en las tasas de supervivencia en los últimos 30 años ^7,53. Además, se necesitan encontrar nuevos enfoques terapéuticos para los casos de LLA de alto riesgo, cuyo pronóstico sigue siendo desfavorable aún con la aplicación de una terapia intensiva. Para ello es necesario conocer con mucha más profundidad las alteraciones moleculares que son responsables de la resistencia a estos tratamientos ⁵³.

 

La integración de múltiples técnicas diagnósticas, desde los métodos convencionales hasta las tecnologías más avanzadas, ha revolucionado el abordaje clínico de la Leucemia Linfoide Aguda (LLA). Si bien las técnicas tradicionales como el hemograma, el análisis morfológico y las tinciones citoquímicas siguen siendo fundamentales en el diagnóstico inicial, su sensibilidad y especificidad han sido complementadas por herramientas más precisas, como la citometría de flujo, el cariotipo convencional y la hibridación in situ por fluorescencia (FISH). A su vez, los enfoques moleculares como RT-PCR y la secuenciación de nueva generación (NGS) han permitido detectar con mayor precisión las alteraciones genéticas y los subtipos de riesgo, facilitando así la estratificación del tratamiento y la medición de la enfermedad mínima residual (EMR). Estos avances no solo han incrementado las tasas de supervivencia, especialmente en países desarrollados, sino que también subrayan la necesidad urgente de implementar dichas tecnologías en países en vías de desarrollo para reducir la brecha existente en el acceso a un diagnóstico preciso y oportuno.

   CONCLUSIONES