Cromatografía de intercambio catiónico de lecho fijo SP Sepharose Fast Flow como alternativa tecnológica en la purificación del FCE-hr
SP Sepharose Fast Flow Fixed-Bed Cation Exchange Chromatography as a Technological Alternative for the Purification of rhEGF
Yadaimis Rodríguez Hernández 
1*, Ana Ibis Paz Li ¹, Madelin Mayeta Aguilera ¹, Miladys Limonta Fernández ¹,², Dayana Soler Sánchez ¹, Jordy Roller de la Cruz ¹, Odalys Ruiz Hernández ¹
1*, Ana Ibis Paz Li ¹, Madelin Mayeta Aguilera ¹, Miladys Limonta Fernández ¹,², Dayana Soler Sánchez ¹, Jordy Roller de la Cruz ¹, Odalys Ruiz Hernández ¹1 Centro de Ingeniería Genética y Biotecnología, La Habana, Cuba
Emails: ana.paz@cigb.edu.cu; madelin.mayeta@cigb.edu.cu; dayana.soler@cigb.edu.cu; jordy.roller@cigb.edu.cu; odalys.ruiz@cigb.edu.cu
2 GENFARMA, Hanoi City, Vietnam
Email: miladys@genfarma.vn
* Correspondencia: yadaimis.rodriguez@cigb.edu.cu
RESUMEN
El Factor de Crecimiento Epidérmico humano recombinante, expresado en Saccharomyces cerevisiae, se utiliza en la formulación de tratamientos eficaces que promueven la regeneración tisular y facilitan la cicatrización de heridas complejas. El proceso de obtención de esta proteína, desarrollado a escala de laboratorio, emplea una cromatografía de intercambio catiónico con resina expandida como etapa de captura. Sin embargo, los avances en la ingeniería de bioprocesos han establecido la cromatografía de lecho fijo como estándar industrial al ofrecer un control hidrodinámico superior, mayor resolución y robustez, mediante la reducción del back-mixing y la dispersión axial, lo que permite una separación más eficiente de los contaminantes. Por ello, resulta recomendable explorar el uso de un intercambiador catiónico de lecho fijo SP Sepharose Fast Flow como alternativa. Para este propósito, se determinaron las condiciones de adsorción y lavado a escala analítica, y se evaluó su reproducibilidad a escala de laboratorio. Los resultados mostraron una eficiencia de adsorción del 95 % y una capacidad dinámica de unión de 2 g de proteína/L de resina, a fuerza iónica neutra, con un tiempo de residencia de 10 min. El lavado con NaCl 0,1 mol/L incrementó la pureza sin pérdidas significativas de proteína, y la elución se realizó mediante la variación del pH, manteniendo la calidad del eluato final a pH 5,6. La implementación de estas condiciones permitió separar los contaminantes presentes en el sobrenadante de fermentación, aumentar la pureza hasta el 72 % y alcanzar una recuperación proteica del 84 %.
Palabras clave: eficiencia de adsorción; factor de crecimiento epidérmico humano recombinante; lecho fijo; pureza; recuperación.
ABSTRACT
Recombinant human Epidermal Growth Factor (rhEGF), expressed in Saccharomyces cerevisiae, is used to formulate effective treatments that promote tissue regeneration and facilitate the healing of complex wounds. The production process for this protein, developed at the laboratory scale, uses expanded-bed cation-exchange chromatography as a capture step. However, advances in bioprocess engineering have established fixed-bed chromatography as the industrial standard due to its superior hydrodynamic control, higher resolution, and robustness, achieved by reducing back-mixing and axial dispersion, thereby enabling more efficient contaminant separation. Therefore, it is recommended to explore using an SP Sepharose Fast Flow fixed-bed cation exchanger as an alternative. For this purpose, adsorption and washing conditions were determined at an analytical scale, and their reproducibility was evaluated at a laboratory scale. The results demonstrated an adsorption efficiency of 95% and a dynamic binding capacity of 2 g protein/L of resin at neutral ionic strength, with a residence time of 10 min. Washing with 0.1 mol/L NaCl increased purity without significant protein loss, and elution was performed by adjusting the pH to 5.6, maintaining the quality of the final eluate. Implementing these conditions enabled the separation of contaminants from the fermentation supernatant, increasing purity to 72% and achieving a protein recovery of 84%.
Keywords: adsorption efficiency; fixed bed; purity; recombinant human Epidermal Growth Factor (rhEGF); recovery.
Gráfico Resumen. Esquema del proceso de purificación de rhEGF mediante SP Sepharose Fast Flow en lecho fijo. Panel 1: Clarificado de fermentación de S. cerevisiae (pH 5,0-5,5; 8 mS/cm). Panel 2: Adsorción selectiva de rhEGF (verde) a la
resina catiónica; las impurezas (gris) no se retienen. Condiciones: 2 g de proteína/L de resina, 10 min. Elución: pH 5,6. Panel3: Comparación vs. lecho expandido: la alternativa de lecho fijo aumenta pureza (58% → 72%) y la recuperación (63% → 84%). Datos como media ± DE (n = 10). rhEGF intacto al final del proceso.
INTRODUCCIÓN
La medicina regenerativa es un campo en desarrollo que busca restaurar la función y la estructura de los tejidos dañados mediante enfoques basados en la regeneración y la reparación celulares. Entre los problemas que enfrenta esta disciplina, la cicatrización inadecuada de tejidos figura entre los más preocupantes, ya que puede conducir a la formación de cicatrices hipertróficas, heridas crónicas o pérdida funcional prolongada, lo que prolonga la recuperación y puede generar complicaciones severas.1
En este contexto, el Factor de Crecimiento Epidérmico humano recombinante (FCE-hr), compuesto por 53 aminoácidos, con un punto isoeléctrico de 4,62 y un peso molecular de 6 kDa, se ha consolidado como un agente terapéutico con amplias aplicaciones clínicas y dermatológicas.2,3,4 Su capacidad para estimular la proliferación y migración de células epiteliales, así como para favorecer la formación y reorganización del tejido de granulación, constituye la base de su uso en los procesos de reparación tisular y cicatrización de heridas complejas.3,5,6
La obtención de esta proteína implica una etapa de fermentación, seguida de una secuencia de pasos de purificación, en la que la cromatografía de intercambio catiónico en lecho expandido permite la captura inicial de la proteína.
La cromatografía de lecho fijo con la resina de intercambio catiónico SP Sepharose Fast Flow, ampliamente utilizada en procesos industriales, emerge como una variante prometedora que ha demostrado diversas ventajas. Su estructura de empaquetamiento estable disminuye la ocurrencia de canalizaciones y favorece una distribución de flujo uniforme que minimiza la dispersión axial y el back-mixing, lo que permite operar a velocidades lineales de hasta 700 cm/h y resistir presiones elevadas. Estas características permiten una mayor resolución y una separación más eficiente de las impurezas, por lo que se decidió explorar este método.
Diversos estudios reportan que esta matriz ofrece perfiles de elución más definidos y una elevada capacidad de purificación en aplicaciones a escala industrial.7,8 Además, operar con lecho empacado evita la acumulación de sólidos en la malla inferior, un problema frecuente cuando se trabaja con flujo ascendente en lecho expandido, lo que provoca obstrucciones que requieren paradas de mantenimiento habituales. Prescindir de este fenómeno, junto con eliminar los cambios de expansión, podría favorecer la reducción del tiempo de operación. Su alta capacidad de unión, reproducibilidad y escalabilidad probada, combinadas con su estabilidad química, la convierten en una herramienta ideal en procesos industriales de purificación de proteínas.8,9,10
A diferencia de trabajos previos que emplean SP Sepharose Fast Flow en otros contextos, esta investigación aporta elementos novedosos y específicos para la purificación del FCE-hr. Dentro de estos se encuentran la optimización sistemática de las condiciones de adsorción, la demostración de mejoras en el proceso al operar con lecho fijo y su validación a escala de laboratorio, manteniendo la calidad del producto. El valor tecnológico del estudio radica, por tanto, en la implementación de esta matriz como alternativa al proceso establecido, no en el uso genérico de la resina. Por ello, esta investigación busca obtener un esquema de purificación robusto, capaz de aumentar los parámetros críticos de pureza y de recobrado mediante el establecimiento de la cromatografía de lecho fijo con matriz SP Sepharose Fast Flow como alternativa sólida para el proceso.
MATERIALES Y MÉTODOS
Material biológico de partida
El material utilizado proviene de varios lotes de fermentación que contienen la proteína FCE-hr, expresada de manera extracelular y soluble en la levadura Saccharomyces cerevisiae, previamente transformada con un plásmido que contiene el promotor-terminador de gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) y la señal de secreción del factor α.
Estudio de las condiciones de adsorción de la proteína FCE-hr empleando la resina SP Sepharose FF en lecho fijo
El material inicial fue el sobrenadante de fermentación ajustado a pH 3,6 y a una conductividad de 8 mS/cm. Los ensayos se realizaron a escala analítica en una columna cromatográfica HiTrap SP Sepharose FF de 1 mL de resina previamente equilibrada, trabajando en un sistema cromatográfico automatizado Äkta pure con un flujo constante de 1 mL/min.
Las soluciones empleadas en los experimentos de adsorción contenían 0,05 mol/L de acetato de sodio y 0,005 mol/L de ácido etilendiaminotetraacético sal disódica (EDTA, del inglés ethylenediaminetetraacetic acid) para garantizar la estabilidad de la proteína.
En el estudio se realizó un diseño experimental (DOE, del inglés design of experiments) factorial 32 para determinar las mejores condiciones de adsorción, utilizando el programa estadístico Statgraphics Centurion versión XVII.II. El diseño generó 9 corridas experimentales con 1 réplica en cada punto, para un total de 18 corridas. Las variables de diseño o factores analizados fueron la carga (2, 8 y 14 g de proteína/L de resina) y la concentración de la sal binaria NaCl (0, 0,05 y 0,1 mol/L) en la solución de equilibrio. La variable respuesta medida para determinar las mejores condiciones, fue la eficiencia de adsorción, definida por la ecuación (1). Las muestras de la fracción no adsorbida y de la inicial se cuantificaron mediante la técnica analítica ELISA.
donde:
masa inicial: masa inicial aplicada de la proteína FCE-hr (g)
masa no adsorbida: masa de la proteína FCE-hr que se pierde en la fracción no adsorbida (g)
Una vez identificado el espacio de diseño en el que se obtuvieron los mejores resultados, se desarrolló una curva de ruptura a partir de tres corridas experimentales, para determinar la capacidad dinámica de unión del FCE-hr al lecho empacado. La composición del tampón de equilibrio resultante del análisis del DOE se mantuvo constante. Durante la aplicación del material se tomaron muestras cada 20 min, lo que permitió estudiar el intervalo de carga (g de proteína/L de resina) seleccionado. La cuantificación de proteínas se realizó mediante el método de Bradford y la pureza mediante RP-HPLC.
A partir de los resultados obtenidos, se realizó una cinética de adsorción en modo discontinuo. Se evaluaron varios intervalos (1, 5, 15, 25, 35 min) para determinar si el tiempo de retención (tr) tiene un efecto significativo que minimice la pérdida de la proteína de interés, cuando se trabaja a una capacidad dinámica de adsorción mayor a la obtenida en la curva de ruptura. En cada condición se realizaron dos réplicas para un total de 15 corridas experimentales, utilizando tubos de centrífuga independientes de 15 mL con resina SP Sepharose Fast Flow previamente equilibrada, a los que se añadió la muestra. Estos se incubaron en una zaranda y, al transcurrir cada intervalo, se centrifugó el material a 2500 rpm durante 5 min. Se tomaron alícuotas del sobrenadante, correspondientes a la fracción no adsorbida, para cuantificar la concentración de proteínas mediante el método de Bradford y determinar la pureza mediante RP-HPLC.
Determinación de las condiciones de lavado en la cromatografía SP Sepharose FF a escala analítica
Se realizaron tres corridas experimentales con un gradiente escalonado de fuerza iónica creciente, desde 0,05 hasta 0,25 mol/L de cloruro de sodio, manteniendo constantes las concentraciones de 0,05 mol/L de acetato de sodio y 0,005 mol/L de EDTA en cada condición. En la ejecución del experimento se empleó una columna HiTrap SP Sepharose FF de 1 mL de resina, operando en las mejores condiciones de adsorción y manteniendo constante un caudal volumétrico de 1 mL/min. En cada condición de fuerza iónica evaluada se colectó la fracción de lavado cuando la señal UV mostró un incremento, y se continuó hasta que la absorbancia alcanzó el 10 % del valor máximo alcanzado. Las muestras obtenidas se analizaron mediante ELISA para determinar la concentración de la proteína de interés y definir el porcentaje de recobrado según la ecuación (2), mientras que la pureza se cuantificó mediante RP-HPLC.
donde:
masa inicial: masa inicial aplicada de la proteína FCE-hr (g)
masa final: masa final de la proteína FCE-hr, colectada en cada condición de lavado (g)
Reproducibilidad de los resultados obtenidos de escala analítica a escala de laboratorio en la cromatografía de intercambio catiónico
Para demostrar la consistencia de los resultados obtenidos a escala analítica, se realizaron 10 corridas experimentales a escala de laboratorio utilizando una columna XK 50/30 con 500 mL de resina SP Sepharose Fast Flow. Se mantuvieron constantes la carga, el tr y la composición de la solución de equilibrio.
Al material proveniente del área de fermentación se le ajustaron el pH y la conductividad antes de ser filtrado mediante cápsulas desechables Sartobran P (0,45 ± 0,2 µm). Esto evitó la obstrucción de la malla distribuidora y garantizó un flujo homogéneo a través del empaquetamiento. Después de equilibrar la columna, se procesó la muestra inicial y se aplicaron 2 volúmenes de columna de la solución de equilibrio para estabilizar las condiciones. El paso de lavado se realizó empleando 4 volúmenes de columna del tampón de lavado, según la condición establecida en el estudio de fuerza iónica creciente. La elución de la proteína FCE-hr se efectuó variando el pH de 3,6 a 5,6 en un tampón amortiguador con agitación constante.
Determinaciones analíticas
La concentración de proteínas se determinó mediante el método de Bradford, midiendo el cambio diferencial de absorbancia de un colorante en presencia de proteína en la muestra.11 La concentración de la proteína de interés se determinó mediante el método inmunoenzimático ELISA (del inglés Enzyme-Linked Immunosorbent Assay). Este ensayo de tipo sándwich detecta la unión del FCE-hr al anticuerpo de captura, y la reacción enzimática es revelada con el sustrato específico para la enzima conjugada al anticuerpo de detección. 12
El análisis de pureza se realizó mediante cromatografía de fase inversa (RP-HPLC, por sus siglas en inglés, Reverse-Phase High-Performance Liquid Chromatography) utilizando una columna C18 con una fase polar. Las proteínas se eluyeron aumentando gradualmente la polaridad apolar de la fase móvil con un solvente orgánico. Se integró el área bajo la curva del perfil obtenido. La pureza determinada corresponde a la suma de las áreas de las especies de 51 y 52 aminoácidos del FCE-hr.
La actividad biológica se determinó mediante un ensayo de proliferación celular dependiente de la dosis, que cuantifica la capacidad funcional de la proteína para estimular la división y el crecimiento de la línea fibroblástica murina 3T3 clon A31. Dado que se trata de una línea celular de origen comercial que no implica el uso de animales vivos, esta técnica no requirió la aprobación de un comité de ética en experimentación animal. Por otra parte, la verificación de la masa molecular intacta y de la correcta formación de los enlaces disulfuro se realizó mediante espectrometría de masas en un espectrómetro híbrido ortogonal QTOF‑2, equipado con fuente de ionización por electronebulización Z‑spray (ESI-MS). Ambos ensayos se llevaron a cabo conforme a los procedimientos y patrones de operación establecidos en el centro para el control de la calidad de productos biotecnológicos, y siguiendo las normas de bioseguridad y las buenas prácticas de laboratorio.
RESULTADOS
Estudio de las condiciones de adsorción de la proteína FCE-hr empleando la resina SP Sepharose FF en lecho fijo
Diseño experimental
Los resultados de la ejecución del diseño experimental se procesaron y analizaron. En la Figura 1 se muestra el diagrama de Pareto estandarizado para determinar qué efectos son estadísticamente significativos y su incidencia en la eficiencia de adsorción, con un nivel de confianza del 95 %. En este se observa el efecto de las variables estimadas, ordenadas por su importancia decreciente.
Figura 1. Diagrama de Pareto estandarizado del diseño experimental factorial 32 para el análisis de la influencia de la concentración de cloruro de sodio y la carga en la eficiencia de adsorción (%). A. Carga (g de proteína/L de resina); B. Concentración de NaCl (mol/L).
El diagrama muestra que las variables carga (A) y concentración de NaCl (B) tienen un efecto significativo y negativo sobre la variable de respuesta. Las interacciones (AA, BB, AB) entre las variables estudiadas no influyen de manera significativa en la eficiencia de adsorción.
Luego de analizar los factores que influyen en la variable dependiente, se ajustó la regresión excluyendo los términos no significativos. La ecuación (3), derivada del análisis para la eficiencia de adsorción, muestra los valores del modelo ajustado que describe la relación con 2 factores independientes y explica el 91,46 % (R-cuadrado) de la variabilidad de los datos.
El error estándar de la estimación indica que la desviación estándar de los residuos es de 2,35; este valor puede emplearse para construir los límites de confianza de las nuevas observaciones. El valor promedio de los residuos es de 1,55 (error absoluto medio MAE) y el estadístico de Durbin-Watson (DW) es 2,47 (mayor que 2). Su valor-P es 0,748 (mayor que 0,05), por lo que no hay indicación de autocorrelación serial en los residuos. Las pruebas de calidad del ajuste realizado indican que el modelo predice con claridad el comportamiento de la variable de respuesta, por lo que puede considerarse satisfactorio.
En la Figura 2, correspondiente a los efectos de las variables independientes, se observan los cambios estimados en la variable dependiente cuando cada factor varía de un nivel inferior a uno superior. La carga, como factor independiente, tiene un efecto positivo sobre la eficiencia de adsorción cuando se trabaja a menores valores de la variable (carga: 2 g de proteína/L de resina), mejorándola significativamente. Sin embargo, a medida que la carga aumenta (14 g de proteína/L de resina), su valor disminuye notablemente.
Figure 2. Gráfico de los efectos principales de las variables independientes sobre la eficiencia de adsorción (%). (a) Carga (Q); (b) Concentración de cloruro de sodio (NaCl).
De igual forma, la concentración de NaCl ejerce un efecto negativo sobre la variable de respuesta, puesto que a mayores molaridades aumenta la competencia iónica, mientras que a bajas concentraciones de NaCl (0 mol/L) este fenómeno disminuye.
La estimación del comportamiento del sistema respecto a la variable eficiencia de adsorción se realiza mediante la construcción de un gráfico de superficie de respuesta que considera las dos variables independientes cuantitativas evaluadas: la carga y la concentración de NaCl. En la Figura 3 se observa el gráfico correspondiente, que muestra que el espacio de diseño para los mejores resultados se obtuvo con una carga de 2 g de proteína/L de resina, sin concentración de NaCl. El modelo ajustado predice que la eficiencia de adsorción de la proteína en la resina, bajo estas condiciones, es del 98 %.
Figura 3. Superficie de respuesta estimada para determinar las mejores condiciones del diseño experimental. Se analiza la influencia de la concentración de cloruro de sodio y de la carga sobre la eficiencia de adsorción (%) del FCE-hr. El círculo rojo indica que la mejor condición del estudio se encuentra en un extremo local.
En la Figura 4 se comparan los cromatogramas obtenidos al operar con una carga de 2 g de proteína/L de resina y emplear las distintas concentraciones de NaCl contempladas en el diseño. Se observa que la señal de absorbancia es menor cuando se utilizan tampones de acetato de sodio a 0,05 mol/L y 0,005 mol/L de EDTA, sin NaCl, lo que corrobora una mayor adsorción de la proteína en ausencia de sal binaria en comparación con las restantes condiciones del estudio.
Figura 4. Cromatogramas del experimento de adsorción en la resina SP Sepharose FF, cuando se emplea una carga de 2 g de proteína/L de resina, combinados con las diferentes concentraciones de NaCl estudiadas en el diseño.
Curva de ruptura
La curva de ruptura es una representación fundamental del comportamiento dinámico de los sistemas de adsorción en lecho fijo, en la que la interacción entre el fluido y la fase estacionaria determina la eficiencia del proceso. A medida que una solución fluye a través del lecho, los solutos son retenidos por la matriz adsorbente, lo que genera un perfil de concentración en el efluente que evoluciona con el tiempo. Esta curva refleja los fenómenos de transferencia de masa, la cinética de adsorción y la capacidad de saturación del medio.
El análisis de la Figura 5, correspondiente a la curva de ruptura obtenida, permite concluir que la aplicación de 2 g de proteína/L de resina garantiza la adsorción adecuada del FCE-hr. Esto acota el diseño de adsorción para alcanzar una recuperación de al menos el 95 %, que representa la mejor condición de capacidad dinámica para operar con alta eficiencia de adsorción. Más allá de este punto, la eficiencia del sistema decae rápidamente por la decreciente disponibilidad de los sitios de unión a la resina, y el aumento de las pérdidas de proteínas en la fase móvil.
Figura 5. Curva de ruptura para determinar la capacidad dinámica de adsorción del FCE-hr a la resina SP Sepharose FF, a partir de tres corridas experimentales realizadas a escala analítica.
Cinética de adsorción
El tr requerido para lograr la adsorción de la proteína de interés a la resina catiónica SP Sepharose FF, se obtiene mediante la cinética representada en la Figura 6. En esta se muestra el comportamiento de la eficiencia de adsorción en función del tiempo bajo las condiciones descritas en el capítulo de materiales y métodos, utilizando distintas capacidades dinámicas de unión.
Figura 6. Cinética de adsorción de la proteína FCE-hr en la matriz cromatográfica de intercambio catiónico SP Sepharose FF. Cada punto representa la media de tres corridas experimentales a escala analítica. La línea azul corresponde al empleo de una carga de 2 g de proteína/L de resina, mientras que la naranja ilustra el comportamiento de la variable dependiente cuando se opera con 8 g de proteína/L de resina.
Como se observa en la Figura 6, la máxima adsorción del FCE-hr con una carga de 2 g de proteína/L de resina se alcanza cuando se garantiza un tiempo de contacto mínimo de 1 min, y se mantiene un comportamiento prácticamente lineal a partir de ese punto. Por el contrario, al aumentar la carga a 8 g de proteína/L de resina, la adsorción disminuye independientemente del tiempo de contacto.
Para la operación a escala de laboratorio se fijó un tr de 10 min, con el que se obtuvo una eficiencia promedio de 91 % en el estudio en modo discontinuo.
Determinación de las condiciones de lavado en la cromatografía SP Sepharose FF a escala analítica
El experimento se realizó bajo las mejores condiciones de adsorción previamente definidas. Los resultados del gradiente escalonado, reportados en la Tabla 1, indican que en la fracción de 0,05 mol/L de NaCl solo se desprende 1,33 ± 0,26 % de la proteína de interés. Esto demuestra una fuerte interacción electrostática entre los grupos de intercambio de la matriz y la proteína.
Se puede apreciar que, al emplear una concentración de 0,10 mol/L de NaCl, se desorbe un 9,62 ± 0,16 % de FCE-hr, con una pureza de 60,50 ± 0,71 %; mientras que, al utilizar una concentración de 0,15 mol/L de la sal binaria, eluye una parte considerable de la proteína (20,25 ± 5,67 %). Con 0,20 y 0,25 mol/L se obtiene un bajo porcentaje de proteína de interés, asociado al efecto de los lavados preliminares sobre la masa de FCE-hr en la muestra.
Resultados expresados ± desviación estándar (número de corridas experimentales: 3)
Tabla 1. Valores de pureza y recobrado obtenidos en el estudio de lavado escalonado, con NaCl como agente modificador.
En la Figura 7 se muestra el perfil cromatográfico obtenido por RP-HPLC, cuyo análisis evidencia la ausencia de pérdidas significativas tanto en la fracción no adsorbida como en el lavado con 0,05 mol/L de NaCl. En los lavados con concentraciones de 0,10 y 0,15 mol/L de NaCl, se empiezan a observar las especies correspondientes al FCE-hr de 51 y 52 aminoácidos. Por otro lado, al emplear las condiciones de 0,20 y 0,25 mol/L de NaCl, se observa un aumento en las especies oxidadas del FCE-hr de 51 y 52 aminoácidos, respectivamente.
Figura 7. Perfil cromatográfico obtenido en RP-HPLC de un experimento de lavado escalonado con NaCl como agente modificador. Se muestra el comportamiento de las especies FCE-hr 51 y FCE-hr 52.
Del análisis realizado se infiere que la mejor condición para la etapa de lavado es el empleo del tampón acetato de sodio 0,050 mol/L con EDTA 0,005 mol/L y cloruro de sodio 0,10 mol/L, debido a que no se observan pérdidas apreciables de proteína y, además, permitirá alcanzar una pureza superior al realizar la posterior elución de la proteína mediante el cambio de pH.
Reproducibilidad de los resultados obtenidos de escala analítica a escala de laboratorio en la cromatografía de intercambio catiónico
La reproducibilidad de los resultados obtenidos es un criterio fundamental para el establecimiento y aplicación de una etapa cromatográfica. Con el objetivo de evaluar el correcto funcionamiento de la resina SP Sepharose Fast Flow como intercambiador catiónico en lecho fijo a escala de banco, se procesaron diez lotes de fermentación bajo las mejores condiciones de operación determinadas a escala analítica. La elución de la proteína se efectuó por variación de pH.
En la Figura 8 se observa el cromatograma de la etapa de intercambio catiónico a escala de laboratorio con la resina propuesta, que describe un comportamiento similar al obtenido con la cromatografía de lecho expandido.
Figura 8. Cromatogramas de un proceso de purificación del FCE-hr. (a) (a) Intercambio catiónico con resina en modo expandido; (b) alternativa mediante cromatografía de intercambio catiónico en lecho fijo. Dónde: 1. Fracción no adsorbida; 2. Lavado; 3. Elución. Se observa en la fracción de elución (3, B) un pico más estrecho, que alcanza una mayor absorbancia, lo que indica una mayor concentración del analito en ese tiempo de elución.
En ambos cromatogramas, la primera meseta corresponde a la fracción no adsorbida a la resina, que contiene principalmente el crudo de fermentación centrifugado y ajustado (proteínas secretadas al medio de cultivo). La segunda fracción corresponde al lavado realizado una vez finalizada la aplicación de la muestra; está compuesta por contaminantes que no se removieron en la fracción no adsorbida y que fueron separados de manera eficiente. La última fracción corresponde a la elución de la proteína de interés, en la que se observa un pico más definido. Esto indica una mayor eficiencia cromatográfica debido a un menor ensanchamiento de banda y una mejor concentración del analito en el tiempo de elución.
En la Figura 9 se muestra un gráfico de barras comparativo, del empleo de ambos modos de operación, donde se reportan los valores promedios de pureza y recobrado de las diez corridas experimentales realizadas a escala de laboratorio.
Figura 9. Comparación entre la cromatografía de lecho fijo y la de lecho expandido en cuanto a porcentajes promedio de pureza (barras de color azul) y de recobrado (barras de color naranja), obtenidos a partir de diez corridas experimentales realizadas a escala de laboratorio. Los valores se expresan como una media, para n = 10.
De la comparación de los datos se observa que la media del porcentaje de recobrado y pureza cuando se utiliza la cromatografía de lecho fijo es de 84 ± 2 % y 72 ± 3%, respectivamente. Ambos valores son superiores a los alcanzados con la cromatografía de lecho expandido (63 ± 3 % y 58 ± 4 %, respectivamente). Además, el perfil obtenido en RP-HPLC correspondiente a la fracción eluida de la proteína, Figura 10, muestra el pico mayoritario en un tr de 8,5 min, correspondiente al FCE-hr que contiene la secuencia de 52 aminoácidos, permitiendo cumplir con la relación establecida FCE-hr 51/ FCE-hr 52.
Figura 10. Cromatograma obtenido por RP-HPLC correspondiente a la elución del FCE-hr en un proceso de purificación con SP Sepharose Fast Flow como intercambiador catiónico de lecho fijo.
El eluato obtenido en esta etapa se procesó en los pasos restantes de purificación. El ingrediente farmacéutico activo (IFA) resultante se caracterizó mediante diversas técnicas analíticas acordes con los estándares regulatorios y las buenas prácticas industriales, lo que permitió analizar de forma integral la calidad del purificado. Entre ellas se destacan la evaluación de la actividad biológica específica y el análisis de la masa intacta mediante espectrometría de masas, que además incluyó la verificación de la correcta formación de enlaces disulfuro, críticos para la estabilidad estructural y funcional de la proteína.
La actividad biológica específica del IFA, determinada mediante un ensayo de proliferación celular dependiente de dosis, fue de 12,76×10^5 UI/mL (34,77×10^5 UI/mg). En la Figura 11 se muestran las curvas dosis-respuesta generadas para tres frascos independientes del mismo lote, a partir de las cuales se obtuvo el valor promedio de actividad biológica reportado.
Figura 11. Curvas dosis-respuesta del ensayo de proliferación celular. Standard. Material de referencia. Donde: Sample 1. Control positive; Sample 2. IFA; Sample 3. IFA; Sample 4. IFA. El paralelismo entre las muestras y el estándar de referencia valida el cálculo de la potencia relativa.
Por otra parte, en la Figura 12, correspondiente al espectro ESI-MS de la proteína intacta, se observan los iones multicargados (4+, 5+, 6+ y 7+) asociados a la proteína. El espectrómetro fue previamente calibrado con una mezcla de yoduro de sodio y cesio como estándar de masas (50-2000 Th). La masa molecular determinada (6059,83 Da) corresponde al FCE truncado en su extremo C con 52 aminoácidos en su estructura, como consecuencia de la pérdida del último aminoácido (-Arg53, especie FCE-hr52). Este valor fue obtenido con buena precisión, con un error porcentual de 0,0002 %, inferior al aceptado para el espectrómetro empleado (<0,01%).
Figura 12. Espectro de ESI-MS de la proteína intacta. Los iones multicargados se identifican con las etiquetas A4 (4+), A5 (5+), A6 (6+) y A7 (7+). En la esquina superior derecha, indicada por la letra A, se muestra la masa experimental obtenida del FCE-hr52.
Para verificar la correcta formación de los enlaces disulfuro en la molécula, se analizó mediante ESI-MS la mezcla de péptidos obtenida mediante hidrólisis ácida parcial de la muestra (Figura 13). EI resultado obtenido confirma que los péptidos que contienen cisteínas están unidos mediante enlaces disulfuro entre las Cys 6-Cys 20, Cys 14-Cys 31 y Cys 33-Cys 42.
Los espectros ESI-MS de la proteína intacta y de la hidrólisis parcial (Figuras 12 y 13) se compararon directamente con los resultados obtenidos en lotes previos del proceso de referencia.
Figura 13. Espectro de ESI-MS de la hidrólisis ácida parcial del FCE-hr. Se identifican con líneas discontinuas negras los péptidos que forman enlaces disulfuro en la molécula.
DISCUSIÓN
El establecimiento de una etapa cromatográfica no se limita a la separación de especies, sino que exige el estudio de parámetros operativos a escala analítica, cuya optimización determina la resolución y la pureza alcanzadas, así como la robustez del método.
La eficiencia de adsorción es una variable importante, debido a que indica la calidad de la transferencia selectiva de la proteína de interés desde la fase fluida a la superficie de partículas rígidas insolubles empaquetadas en la columna. Los resultados del diseño experimental mostraron que el empleo de 2 g de proteína/L de resina mejora significativamente la adsorción debido a la no saturación de la matriz. Esto permite una unión eficiente y selectiva, ya que los sitios activos de la resina permanecen disponibles y no hay competencia entre las moléculas de FCE-hr.
En contraste, al aumentar la carga a 14 g de proteína/L de resina, los sitios de unión se ocuparon rápidamente y parte de la proteína no logró adsorberse, pasando sin retenerse a través de la columna. Esta tendencia concuerda con lo reportado por Challener en 2023,13 quien demostró que el incremento de la carga másica disminuye la captura de la proteína al exceder la capacidad de unión dinámica del adsorbente, otro parámetro relevante en procesos cromatográficos que se analizará en lo adelante.
En cuanto a la concentración de NaCl, se observó que el aumento en la molaridad de la sal propicia la competencia iónica, los contraiones Na⁺ presentes en la solución compiten de manera efectiva con el FCE-hr por los sitios de unión en la resina cargada negativamente. Este fenómeno se debe a que los iones Na⁺ tienen una mayor afinidad o movilidad para interactuar con dichos sitios, lo que reduce su disponibilidad para la adsorción de la proteína. Por el contrario, a bajas concentraciones de NaCl (0 mol/L), la competencia iónica es mínima. Esto permite que la proteína (cargada positivamente durante la etapa de adsorción) se una con mayor eficiencia a la resina. El comportamiento observado se alinea con la teoría DLVO (Derjaguin-Landau-Verwey-Overbeek), que describe las interacciones electrostáticas en sistemas coloidales, y con los principios de este tipo de cromatografía, donde la fuerza iónica modula la interacción proteína-resina.14,15,16
El resultado obtenido coincide con los estudios realizados por Montes de Oca y colaboradores en el año 2024, cuando evaluaron el efecto de la concentración de NaCl en la adsorción de los antígenos Soberana®02, Soberana® Plus y Soberana 01 en una columna Hitrap SP Sepharose Fast Flow, donde un incremento de conductividad disminuyó el porcentaje de adsorción.17
El análisis de la curva de ruptura de la Figura 5 mostró que, inicialmente, cuando el fluido entra en contacto con el lecho, la zona de transferencia de masa se localiza cerca de la entrada de la matriz, a valores bajos de carga aplicada. La concentración de soluto en el efluente de esta zona cae abruptamente debido a la alta afinidad del adsorbente. En esta fase se opera en condiciones cercanas a las ideales, con una retención eficiente del soluto. Sin embargo, conforme avanza el tiempo, la región cercana a la entrada se satura progresivamente y desplaza la zona de transferencia de masa hacia el interior del lecho. Este fenómeno genera el característico perfil sigmoide de la curva de ruptura, en el que la concentración de salida (Cf) aumenta gradualmente hasta alcanzar el punto de ruptura. Según ha sido reportado por otros investigadores, este punto se encuentra alrededor de un 5-10 % de la fracción Cf/Co (Co corresponde a la concentración inicial).18
En consecuencia, la carga de aplicación seleccionada fue de 2 g de proteína/L de resina según el análisis realizado. Desde el punto de vista comparativo, las capacidades dinámicas reportadas para matrices de intercambio catiónico basadas en agarosa (como SP Sepharose Fast Flow) muestran una marcada dependencia del tamaño y de las propiedades fisicoquímicas. Los valores típicos son del orden de 50-70 mg/mL para proteínas de baja masa molecular, como la ribonucleasa A.19,20
En este contexto, según la masa molecular del FCE-hr, se podrían obtener capacidades relativamente similares a las descritas para esta proteína debido a una rápida difusión en la estructura porosa de la matriz. Sin embargo, este comportamiento no está determinado exclusivamente por el tamaño molecular, sino también por la distribución de carga superficial, la conformación tridimensional y las condiciones de operación, que modulan de forma decisiva la adsorción en resinas de intercambio iónico.21
Por tanto, la condición de 2 g de proteína/L de resina corresponde a una capacidad dinámica inferior a la publicada para estas matrices. Sin embargo, su selección estuvo alineada con una estrategia reconocida en el diseño de procesos downstream, que consiste en garantizar una elevada recuperación (95 %) sobre la utilización de la capacidad total de la resina en una etapa de captura.22
En la literatura se han reportado casos en los que este efecto también se ha observado en proteínas de tamaño similar. Por ejemplo, Putro y colaboradores, en la captura y purificación intermedia del precursor de insulina humana (5,8 kDa), emplearon una columna HiTrap SP HP de 5 mL equilibrada con acetato de sodio 20 mmol/L a pH 4,0. Donde, se obtuvieron cargas máximas de 13,6 mg/mL, que incluso por debajo de la capacidad reportada de la resina permitieron recuperar solamente el 47 % de la insulina, lo cual no representa un problema en esta investigación.20
No obstante, la selección de 2 gramos de proteína/L de resina constituye una limitación del estudio en términos de productividad volumétrica, ya que implica operar por debajo de la capacidad potencial del adsorbente para garantizar la recuperación de la proteína. Aunque esta condición coincide con la empleada en el proceso de referencia, ambos sistemas fueron evaluados a escala de laboratorio; por tanto, la validación a escala industrial no puede inferirse directamente a partir de estos resultados. En la transferencia a planta deberá confirmarse el desempeño del sistema en columnas de mayor diámetro, bajo condiciones de flujo, presión y altura del lecho propias de la escala, ya que estas variables pueden modificar la capacidad dinámica y productividad volumétrica.
Estudios futuros podrían explorar estrategias para incrementar la capacidad de unión del FCE-hr mediante pretratamientos del sobrenadante o el uso de resinas modificadas con dextrano (SP Sepharose XL) para aumentar la exposición y la densidad de los ligandos de intercambio iónico, lo que se traduce en mayores capacidades de carga sin comprometer los resultados. 23
Por otra parte, el tr está asociado al tiempo que tarda una molécula en pasar por la columna cromatográfica, desde la aplicación hasta la detección. Este parámetro es de gran interés porque influye en la correcta adsorción de la proteína a la matriz cromatográfica y garantiza que las pérdidas en la fracción no adsorbida sean mínimas.
El análisis del comportamiento cinético obtenido al operar con una carga de 2 g de proteína/L de resina indicó que el soluto accede rápidamente a la superficie y a los poros internos de la resina durante los tiempos de retención establecidos, lo que minimiza la competencia iónica y permite una adsorción casi completa. Por su parte, la condición explorada de mayor carga (8 g de proteína/L de resina) produjo la disminución de la adsorción independientemente del tiempo de contacto. Esto ocurre porque los sitios activos del gel se agotan y el exceso de soluto no puede adsorberse por más que se incremente el tiempo de contacto. Además, a cargas altas, la competencia entre las proteínas y otros iones puede incrementarse, especialmente si existen diferencias de afinidad entre las especies presentes, lo que reduce la adsorción de la proteína de interés.
Sin embargo, la selección del tr debe alinearse con las condiciones hidrodinámicas del sistema y con las limitaciones operacionales del escalado industrial (flujo-presión). Donde la utilización de columnas de mayor diámetro, operadas con tiempos de retención inferiores a 10 min, requiere altos flujos de trabajo incompatibles con los equipos industriales disponibles en el centro. Además, la velocidad lineal, en la mayoría de los casos, superaría los 700 cm/h, lo que generaría contrapresiones cercanas al límite de la resina (3 bar). Por ello, se seleccionó un tr de 10 min como variable de operación, con el cual se alcanzó una eficiencia de adsorción promedio del 91 %. Es importante destacar que, aun cuando el resultado alcanzado es similar al obtenido en el estudio de las condiciones de adsorción mediante la predicción del modelo ajustado (98 %), se debe considerar que este experimento se realizó en batch, donde la transferencia de masa puede ser menos favorable que en un sistema de flujo axial.
No obstante, el perfil cinético del FCE-hr, caracterizado por una alta eficiencia de adsorción desde el tiempo de contacto mínimo evaluado, concuerda con el comportamiento reportado para proteínas de bajo peso molecular en resinas de intercambio catiónico, como se evidencia en la investigación previamente referenciada de Putro. Donde demostraron que variaciones del flujo de carga (± 20 % respecto a 4,6 mL/min) no modifican la recuperación, lo que refleja una cinética de adsorción independiente del tr en ese rango (0,91-1,36 min).20 Esta correspondencia confirma que la eficiencia del 91 % obtenida para el FCE-hr a los 10 min se sitúa dentro del estado del arte para biomoléculas con características fisicoquímicas análogas.
En cuanto a la etapa de lavado, se sabe que constituye un paso crítico para aumentar la pureza del producto en los métodos cromatográficos, al eliminar impurezas que coeluyen con la proteína de interés debido a una resolución insuficiente entre los picos o a interacciones electrostáticas más débiles. Del análisis de la Figura 7, que integra el perfil obtenido por RP-HPLC para las diferentes condiciones exploradas en el estudio, se identificó el tampón de lavado con una concentración del agente modificador de 0,1 mol/L, lo que permitió elevar la pureza del producto por encima del 70 %.
En el estudio, bajas concentraciones de sal (0,05 mol/L) hacen que las biomoléculas permanezcan unidas a la resina debido a que predominan las interacciones electrostáticas. A medida que aumenta la concentración de NaCl (0,1 mol/L), se apantallan las cargas, incrementando la competencia y reduciendo el potencial electrostático efectivo entre la resina y la biomolécula. Esta condición permite separar selectivamente impurezas con una menor densidad de carga que la de la proteína, elevando la pureza sin provocar grandes pérdidas de la proteína de interés. Además, se observó que un aumento de la molaridad influye en modificaciones postraducionales del FCE-hr como la oxidación. Este comportamiento puede atribuirse a que una mayor fuerza iónica induce cambios conformacionales en la proteína, exponiendo residuos sensibles, como la metionina, a un entorno más propenso a la oxidación,24 lo que disminuye considerablemente la pureza de la muestra y, en ocasiones, la actividad biológica.
En una investigación realizada por Eguia y colaboradores, se utilizó como primer paso de purificación de nartograstim una columna con resina SP Sepharose (30 mL, XK 16/20), la cual se equilibró con tampón de acetato de sodio 0,020 mol/L y 0,050 mol/L de NaCl a pH 5,0 y a un flujo de 5 mL/min. Después de cargar la muestra, la matriz se lavó con 10 volúmenes de columna del tampón de equilibrio y la elución se realizó en dos pasos, con un incremento de la fuerza iónica. El resultado reflejó una pureza final cercana al 80 %, valor que resulta favorable y comparable al obtenido en el presente estudio, aunque con una baja recuperación (50 μg por gramo de células húmedas), a diferencia de lo obtenido con la alternativa tecnológica propuesta.25
Finalmente, la reproducibilidad del proceso a escala de laboratorio permitió verificar que las condiciones seleccionadas condujeron a un perfil cromatográfico similar al obtenido en modo expandido. Esto indica que los parámetros y las condiciones operacionales fueron seleccionados correctamente, lo que mejoró la resolución y la hidrodinámica del sistema. Asimismo, las interacciones proteína-resina se conservaron y se alcanzó una eficiencia de adsorción promedio del 95 %, representativa del proceso a escala de laboratorio, utilizando la columna de lecho fijo con flujo axial. Los valores de recobrado y pureza alcanzados se consideran adecuados para la etapa de captura del FCE-hr y son superiores a los obtenidos al operar con lecho expandido.
Si bien la cromatografía de lecho expandido fue concebida para integrar la clarificación y captura en una sola operación, su implementación industrial se ha visto limitada por diversos factores técnicos. Entre ellos se encuentran la interacción entre las partículas sólidas del caldo de fermentación y la matriz adsorbente, que puede comprometer la estabilidad del lecho fluidizado; los prolongados tiempos de limpieza, que afectan la productividad del proceso; y la complejidad hidrodinámica del sistema, que dificulta el escalado y compromete la reproducibilidad entre lotes. Estos desafíos han orientado los desarrollos recientes hacia el empleo de la cromatografía de lecho fijo por su control hidrodinámico predecible, que minimiza el back-mixing y la dispersión axial. Sin embargo, esta estrategia también presenta limitaciones, ya que requiere una alimentación clarificada, libre de partículas o restos celulares.26,27
Las técnicas analíticas realizadas al IFA obtenido complementaron y respaldaron la robustez de la alternativa tecnológica. El valor de actividad biológica obtenido fue consistente con la actividad descrita para la preparación de referencia 91/550 en el estudio de Robinson y Gaines-Das,28 que estableció el estándar internacional de la OMS para esta molécula;29 lo que evidencia que el FCE-hr conserva su capacidad miogénica, aspecto clave para demostrar la potencia exigida en productos biológicos según las guías de caracterización de bioproductos. 30Asimismo, se comprobó que la masa molecular obtenida estuviera en correspondencia con la teórica reportada para esta proteína y se verificó la correcta formación de tres puentes disulfuro intramoleculares producto de seis residuos de cisteínas, fundamentales para el efecto y la afinidad sobre su receptor de membrana; lo cual coincide con lo citado en la literatura para la molécula nativa y con los resultados de lotes anteriores obtenidos en el Centro de Ingeniería Genética y Biotecnología (CIGB) con el proceso de referencia.31 Esta evidencia respalda la correcta formación de los puentes disulfuro críticos para la estabilidad estructural y la actividad biológica de la proteína.
La coherencia entre el perfil de pureza, la actividad biológica medida y el análisis mediante espectrometría de masas indica que el purificado evaluado corresponde a la proteína correctamente estructurada, con alta afinidad de unión y activación eficiente de las vías de señalización celular responsables de la cicatrización y la regeneración tisular. Por tanto, la estrategia propuesta en esta investigación puede implementarse, pues garantiza que los cambios realizados en la etapa de captura no afectan la integridad de la molécula y permiten mejorar parámetros esenciales para el éxito de un producto biotecnológico, como la pureza y el recobrado.
Aunque la matriz SP Sepharose Fast Flow constituye una referencia en la industria, la investigación sobre nuevos materiales para la purificación y la eliminación de impurezas sigue en constante evolución. En este contexto, la literatura explora el uso de resinas modificadas o multimodales, que podrían constituir una estrategia efectiva para separar las especies oxidadas detectadas en los lavados con mayor fuerza iónica. Estas tecnologías emergentes ofrecen un camino a explorar para alcanzar purezas superiores, así como para lograr la remoción de endotoxinas y de contaminantes procedentes de las células hospederas.32,33Además, existen estudios recientes que reorientan el uso de las resinas clásicas hacia nuevas funcionalidades; en este sentido, Prabhala y Wood demostraron que la resina SP Sepharose Fast Flow puede actuar como soporte de afinidad cuando la proteína de interés se fusiona con una etiqueta de unión a heparina. Este diseño permite a la etiqueta realizar una captura selectiva que trasciende la separación por carga neta convencional, elevando la pureza mediante su eliminación en un segundo paso.34
Como perspectiva futura para la transferencia tecnológica de la alternativa propuesta para la purificación del FCE-hr, se recomienda validar el escalado del proceso en columnas de diámetro industrial, verificando que las condiciones establecidas se mantengan sin afectar la resolución cromatográfica, el recobrado ni la pureza. Asimismo, deberá evaluarse el impacto operativo del paso de filtración que exige el lecho fijo, en contraste con las paradas por obstrucción propias del lecho expandido. Un análisis económico que incluya ambas variantes permitirá cuantificar el beneficio neto del cambio tecnológico.
CONCLUSIONES
Se definió como la mejor condición de adsorción una capacidad dinámica de unión de 2 g de proteína/L de resina y un tiempo de retención de 10 min, lo que permitió alcanzar una eficiencia de adsorción del 95 %, facilitando la captura del producto.
El estudio de lavado escalonado empleando NaCl, sugirió controlar la concentración salina a 0,10 mol/L, lo cual incrementó la pureza 1,14 veces con la separación eficiente de los contaminantes, sin comprometer la integridad de la molécula, ni afectar significativamente la cantidad de proteína recuperada.
Los resultados obtenidos a escala de laboratorio indicaron que el empleo de la resina SP Sepharose Fast Flow bajo las mejores condiciones de operación, permitió alcanzar un recobrado del 84 % y una pureza del 72 %, ambos superiores a los obtenidos con la cromatografía de lecho expandido, sin afectar las características del FCE-hr.
Supplementary Materials / Materiales Suplementarios:
No hay materiales suplementarios disponibles para este artículo. Las curvas de ruptura completas, los cromatogramas originales y los datos brutos de las diez corridas experimentales a escala de laboratorio están disponibles, bajo solicitud razonable, al autor correspondiente.
Author Contributions / Contribuciones de los Autores:
Todos los autores contribuyeron a la concepción de la investigación, la metodología, la ejecución, el análisis e interpretación de datos, la redacción, la revisión crítica, la edición y la visualización. Los autores han leído y aprobado la versión final del manuscrito.
Funding / Financiamiento:
Esta investigación no recibió fondos externos.
Institutional Review Board Statement / Declaración del Comité de Revisión Institucional:
No aplica. Este estudio no incluyó participantes humanos, animales ni datos clínicos identificables. El ensayo de actividad biológica utilizó la línea fibroblástica murina 3T3 clon A31 (de origen comercial), que no requiere aprobación de un comité de ética en investigación animal.
Informed Consent Statement / Declaración de Consentimiento Informado:
No aplicable. Este artículo no incluye datos originales de pacientes ni información clínica identificable.
Data Availability Statement / Declaración de Disponibilidad de Datos:
Los conjuntos de datos generados y analizados durante este estudio, incluidos los parámetros de calidad del sobrenadante de fermentación, los perfiles cromatográficos y los análisis de pureza mediante RP-HPLC, están disponibles del autor correspondiente a solicitud razonable. Los espectros ESI-MS brutos y las curvas de ruptura completas se incluyen como información suplementaria disponible del autor correspondiente.
Acknowledgments / Agradecimientos:
Los autores agradecen a los departamentos del Centro de Ingeniería Genética y Biotecnología (CIGB, La Habana, Cuba) que hicieron posible la realización de las técnicas analíticas empleadas durante la investigación. El Departamento de Análítica de Desarrollo Tecnológico por el análisis de RP-HPLC; el Departamento de Biología de Sistemas por los análisis de ESI-MS; el Departamento de Control de la Calidad por los ensayos de actividad biológica; el Departamento de Control de Procesos por los ensayos de Bradford y ELISA; y el Departamento de Fementación por proporcionar el material biológico.
AI-Assisted Tools Disclosure / Declaración de Uso de Herramientas de IA:
No se utilizaron herramientas de inteligencia artificial generativa en la concepción, la ejecución, el análisis de datos ni la redacción de este manuscrito. Todo el diseño experimental, las corridas cromatográficas, las determinaciones analíticas y los análisis estadísticos fueron realizados por los autores utilizando software de laboratorio estándar (sistema Äkta pure, Statgraphics Centurion XVII.II y sistemas de informática de laboratorio).
Conflict of Interest / Conflicto de Intereses:
Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses. Miladys Limonta Fernández está afiliada a GENFARMA (Vietnam), pero dicha relación no influyó en el diseño, la ejecución ni la publicación de esta investigación.
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Received / Recibido: March 25, 2026 /Accepted / Aceptado: June 2, 2026 / Published (Online First) / Publicado (Versión online anticipada): June 3, 2026 / Issue Date / Fecha de publicación: June 15, 2026 (Europe/Madrid)
Citation / Citación:
Rodríguez Hernández Y, Paz Li AI, Mayeta Aguilera M, Limonta Fernández M, Soler Sánchez D, Roller de la Cruz J, Ruiz Hernández O. SP Sepharose Fast Flow Fixed-Bed Cation Exchange Chromatography as a Technological Alternative for the Purification of rhEGF. BioNatura Journal: Ibero-American Journal of Biotechnology and Life Sciences. 2026;3(2):4. https://doi.org/10.70099/BJ/2026.03.02.4
Correspondence / Correspondencia: yadaimis.rodriguez@cigb.edu.cu
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